難表達(dá)蛋白（difficult-to-express proteins）主要具有以下幾大特點：

漢騰成果

通過轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析，將與難表達(dá)蛋白產(chǎn)量正相關(guān)的順式作用元件插入到表達(dá)載體中，選擇多拷貝載體及難表達(dá)蛋白專用載體，或共表達(dá)蛋白抑制劑、配體等。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可添加專用添加劑，針對不同的細(xì)胞制定對應(yīng)的篩選以及培養(yǎng)工藝，以提高活細(xì)胞密度并有助于延長培養(yǎng)時間，最終達(dá)到提升產(chǎn)量的目的。DTEasy 專有添加劑可只需在培養(yǎng)過程中簡單的單次添加，即可最高提升 3 倍表達(dá)量。漢騰生物建立的 CBoost® 加強型工藝平臺，加強型補料批培養(yǎng)可達(dá)到超過兩倍的蛋白表達(dá)量。此外，由于細(xì)胞需要平衡蛋白表達(dá)和生長，外源蛋白表達(dá)會給細(xì)胞造成較大壓力^[6]。針對這一特點，漢騰生物采用了更為溫和的環(huán)軌搖晃式反應(yīng)器，操作簡便的同時，還可以縮短混合時間、降低剪切應(yīng)力、減少泡沫及污染。

信號肽位于分泌蛋白的 N 端，引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔．而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除。信號肽篩選是增強蛋白分泌的一種重要途徑。選擇不同的信號肽會導(dǎo)致不同的融合蛋白 N 端截短比例，進而可能對融合蛋白的純度和活性產(chǎn)生影響。

針對重組胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）項目，漢騰生物設(shè)計了多種信號肽用于增強 GLP-1 蛋白或 GLP-1 融合蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)（結(jié)果如下，詳細(xì)內(nèi)容參考漢騰專利：信號肽在表達(dá)GLP-1融合蛋白中的應(yīng)用,CN114539357B）。通過不同信號肽的組合，藥物蛋白的純度和生物學(xué)活性得以顯著提升（表 1）。

表1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清中 GLP-1-Fc 融合蛋白的表達(dá)量以及純化后融合蛋白純度

對于某些過量表達(dá)后會引起細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)，如蛋白酶和凝血酶，可以考慮共表達(dá)其抑制劑，減少其表達(dá)給細(xì)胞存活造成的壓力，從而提高蛋白產(chǎn)量。

針對組織型纖溶酶源激活劑（tissue plasminogen activator，t-PA），漢騰生物構(gòu)建了共表達(dá) t?PA 和 t?PA 抑制劑的雙表達(dá)框載體以及一步層析純化工藝（結(jié)果如下，詳細(xì)內(nèi)容參考漢騰專利：t-PA純化方法，CN14426962B）。其中 t?PA 與 t?PA 抑制劑形成的非共價復(fù)合物結(jié)構(gòu)松散，易于分離。此外，目前 t?PA 的純化工藝一般需要 3～4 步才能實現(xiàn) 90％以上的純度，共表達(dá) t?PA 抑制劑后結(jié)合使用賴氨酸親和層析，能夠?qū)崿F(xiàn) t?PA 的一步層析純化（圖 1）。最終 tPA 的純化后產(chǎn)率達(dá) 361.5 mg/L，是現(xiàn)有技術(shù)的 3 倍以上。

圖 1. 賴氨酸親和層析結(jié)果

商業(yè)生產(chǎn)中使用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)充足蛋白質(zhì)的方法主要分為三種：分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。分批培養(yǎng)方法中，所有營養(yǎng)物質(zhì)都在初始基培養(yǎng)基中提供，隨著培養(yǎng)時間延長，營養(yǎng)物質(zhì)不斷減少，乳酸等代謝抑制物增加。補料分批培養(yǎng)是指在培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，可以避免細(xì)胞和代謝過程中的產(chǎn)物以及某些營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏對細(xì)胞的抑制作用。連續(xù)培養(yǎng)是培養(yǎng)過程中不斷灌注培養(yǎng)基能同時清除廢物、提供營養(yǎng)和收獲產(chǎn)品的培養(yǎng)方法。針對不同的難表達(dá)蛋白選擇更合適的細(xì)胞培養(yǎng)方式以及額外補充專用添加劑，有助于提升蛋白產(chǎn)量。

此前，并無高效表達(dá)人類神經(jīng)生長因子（human never growth factor，hNGF）的培養(yǎng)方法，極大限制了 hNGF 的大規(guī)模生產(chǎn)和在臨床與藥物方面的應(yīng)用。漢騰生物采用補料分批培養(yǎng)方法，并發(fā)現(xiàn)了新的添加劑，可以將 hNGF 重組蛋白的表達(dá)量提高至少 100%，產(chǎn)量最高可提升至 2900 mg/L左右（圖 2），較大地提升了 hNGF 在 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)水平（詳細(xì)內(nèi)容參考漢騰專利：重組神經(jīng)生長因子的高效表達(dá)方法，CN2023108028220）。

圖 2. 含有不同濃度添加劑的培養(yǎng)基條件下 β-NGF 蛋白表達(dá)量的柱形圖

攪拌式生物反應(yīng)器是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域常用的反應(yīng)器，由于其攪拌槳易造成剪切力，且其深層通氣方式易產(chǎn)生泡沫從而造成更巨大的剪接力，會對細(xì)胞造成傷害，甚至死亡。此外，攪拌式生物反應(yīng)器在擴大培養(yǎng)過程中，由于涉及的參數(shù)較多，流體力學(xué)復(fù)雜，造成放大困難，甚至失敗。

環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器是一種通過環(huán)軌搖晃混合方式進行細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，可以很好地解決攪拌式生物反應(yīng)器存在的問題。但由于工作原理存在較大差異，攪拌式生物反應(yīng)器的培養(yǎng)條件并不適用環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器。為解決這一問題，漢騰生物成功開發(fā)了一種細(xì)胞培養(yǎng)的方法（詳細(xì)內(nèi)容參考一種使用環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的方法，CN113862224A）。該方法采用梯度增速及降溫的方式培養(yǎng)細(xì)胞，同時對培養(yǎng)基進行適當(dāng)優(yōu)化，細(xì)胞活率以及蛋白表達(dá)量更高（圖 3-4）。

圖 3. 活細(xì)胞密度（VCD）和細(xì)胞活率（VIA）。SB-10：環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器；AK02：3 L攪拌式生物反應(yīng)器；AK15：15 L攪拌式生物反應(yīng)器

圖 4. 蛋白表達(dá)量。SB-10：環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器；AK02：3 L攪拌式生物反應(yīng)器；AK15：15 L攪拌式生物反應(yīng)器

1. Alves, C. S. & Dobrowsky, T. M. Strategies and Considerations for Improving Expression of “Difficult to Express” Proteins in CHO Cells. in Heterologous Protein Production in CHO Cells: Methods and Protocols (ed. Meleady, P.) 1–23 (Springer New York, New York, NY, 2017). doi:10.1007/978-1-4939-6972-2_1.

2. Szkodny, A. C. & Lee, K. H. A systemic approach to identifying sequence frameworks that decrease mAb production in a transient Chinese hamster ovary cell expression system. Biotechnol. Prog. e3466 (2024) doi:10.1002/btpr.3466.

3. Pybus, L. P. et al. Model-directed engineering of ‘difficult-to-express’ monoclonal antibody production by Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 111, 372–385 (2014).

4. Chen, J.-P. et al. Improving the soluble expression of difficult-to-express proteins in prokaryotic expression system via protein engineering and synthetic biology strategies. Metab. Eng. 78, 99–114 (2023).

5. R.R.伯吉斯 & 陳薇. 蛋白質(zhì)純化指南(原書第2版). 中國科技信息 1 (2013).

6. Nishimiya, D. Proteins improving recombinant antibody production in mammalian cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 1031–1042 (2014).