在生物制藥領(lǐng)域，蛋白質(zhì)表達(dá)和產(chǎn)量直接影響著藥物研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。然而，一些蛋白質(zhì)由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和特性被歸類為“難表達(dá)蛋白”，難以在常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。蛋白質(zhì)難以表達(dá)的原因多種多樣，主要涉及分子結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和細(xì)胞環(huán)境等因素。
首先，某些蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，如高二硫鍵密度或多亞基復(fù)合體，使其在合成過程中易于錯誤折疊，進(jìn)而在細(xì)胞中形成不溶性聚集體，影響表達(dá)效率。其次，對于高疏水性或需要特定糖基化修飾的蛋白，如膜蛋白、凝血因子等，細(xì)胞難以在常規(guī)條件下維持其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步加劇表達(dá)困難。此外，某些蛋白質(zhì)本身具有細(xì)胞毒性作用，例如蛋白酶和凝血酶在過表達(dá)時會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致表達(dá)量驟降。外部環(huán)境的影響同樣不可忽視，表達(dá)系統(tǒng)中的異常應(yīng)激反應(yīng)、代謝物濃度的波動或翻譯后修飾的缺失都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不完全表達(dá)甚至降解。
以上這些原因共同導(dǎo)致的難表達(dá)蛋白藥物的表達(dá)量偏低，已經(jīng)成為生物制藥行業(yè)CMC開發(fā)過程中的主要瓶頸。為解決這一長期存在的產(chǎn)業(yè)難題，漢騰生物研發(fā)了專注于難表達(dá)蛋白（Difficult to express protein）的DTEasy工具箱。該平臺以集成優(yōu)化策略為基礎(chǔ)，全面提升難表達(dá)蛋白的產(chǎn)量、穩(wěn)定性和功能性，為客戶難表達(dá)蛋白藥物開發(fā)提供了一個系統(tǒng)化和全面的解決方案。
DTEasy的四大核心策略
DTEasy平臺通過分子改良、宿主選擇、載體優(yōu)化和工藝構(gòu)建四個關(guān)鍵策略，全方位解決難表達(dá)蛋白的表達(dá)挑戰(zhàn)。
分子改良
優(yōu)化蛋白質(zhì)序列，提升穩(wěn)定性與產(chǎn)量
不同分子的表達(dá)情況本就有較大差異，我們對不同分子進(jìn)行序列篩選，對于表達(dá)量不高的分子，我們會采用三個步驟對其進(jìn)行優(yōu)化：
? 密碼子優(yōu)化：通過優(yōu)化密碼子使用，增加分子的表達(dá)量。這一策略不改變分子的氨基酸序列，從而保持蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)不變；
? 序列改造與截短：選擇合適的替代序列，提高分子表達(dá)量，并對蛋白質(zhì)的非功能性片段進(jìn)行截短，以最大限度保留功能性蛋白，進(jìn)而提高表達(dá)量。此外，我們還可以使用融合標(biāo)簽蛋白以提高蛋白的溶解度和產(chǎn)量；
? 抗體序列篩選與基因工程優(yōu)化：針對抗體藥物，通過選擇適當(dāng)?shù)闹劓?輕鏈（VH/VL）框架對，并進(jìn)行基因工程優(yōu)化以調(diào)整重鏈和輕鏈序列，優(yōu)化蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，最終提升蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
在某項(xiàng)目中，我們通過序列風(fēng)險分析和點(diǎn)突變，成功將細(xì)胞池產(chǎn)量提高到原來的7.6倍，且未引起活性改變。
選擇宿主
精心挑選宿主細(xì)胞，適配多種蛋白需求
宿主細(xì)胞的選擇是難表達(dá)蛋白生產(chǎn)的關(guān)鍵。DTEasy平臺的宿主選擇策略基于不同蛋白類型和目標(biāo)應(yīng)用的特性：
? 優(yōu)先選用哺乳動物細(xì)胞：相比其他表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動物細(xì)胞能更好地進(jìn)行蛋白折疊和二硫鍵形成，確保表達(dá)的蛋白具有更高的生物相似性；
? GlycoExpress®（GEX）細(xì)胞系：對于需要高度糖基化修飾的內(nèi)源蛋白，如凝血因子和FSH、GH等激素蛋白，漢騰生物采用專利的GlycoExpress®細(xì)胞系（GEX）。該細(xì)胞系不僅能提升表達(dá)量，其糖基化修飾也更接近人類天然蛋白，適用于具有高度組織特異性的蛋白表達(dá)；
例如，在表達(dá)G 蛋白偶聯(lián)受體 GPCR 的胞外結(jié)構(gòu)域時，GEX® 細(xì)胞系的表達(dá)量相比傳統(tǒng)的 CHO-K1 細(xì)胞系可提升10倍之多。
通過精準(zhǔn)篩選宿主細(xì)胞，能最大限度地提高難表達(dá)蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量，確保其在功能上符合藥物開發(fā)的需求。
優(yōu)化載體
構(gòu)建高效表達(dá)載體，提升蛋白合成效率
表達(dá)載體的設(shè)計會直接影響蛋白合成效率。漢騰生物的DTEasy工具箱通過優(yōu)化一系列措施改造表達(dá)載體系統(tǒng)，提升難表達(dá)蛋白的產(chǎn)量：
? 引入順式作用元件：通過轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析，將與蛋白產(chǎn)量正相關(guān)的順式作用元件插入載體中，從而提升轉(zhuǎn)錄效率；
? 設(shè)計多拷貝載體或?qū)Ｓ幂d體：針對不同類型的重組蛋白，通過選用多拷貝載體或定制的難表達(dá)蛋白專用載體，可提升100%-400%的蛋白產(chǎn)量。
? 添加共表達(dá)抑制劑或配體：加入共表達(dá)抑制劑，以減少難表達(dá)蛋白表達(dá)過程中的細(xì)胞毒性，或添加蛋白特定配體以進(jìn)一步提升表達(dá)量，確保表達(dá)產(chǎn)量提升到最佳水平。
通過以上組合優(yōu)化設(shè)計，DTEasy平臺在難表達(dá)蛋白的合成效率和產(chǎn)量上取得顯著提升，滿足了客戶高標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)需求。
工藝優(yōu)化
定制化上游工藝開發(fā)方案，顯著提高難表達(dá)蛋白產(chǎn)量
在上游工藝開發(fā)中，通過優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件和添加定制培養(yǎng)基添加劑等策略，提升難表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性和表達(dá)量：
? 添加專屬添加劑：在培養(yǎng)過程中添加漢騰獨(dú)有的DTEasy專屬添加劑，能夠增強(qiáng)細(xì)胞對篩選壓力的耐受性，從而將蛋白產(chǎn)量提升至原表達(dá)量的3倍之多；
? 采用環(huán)軌搖晃式反應(yīng)器：通過采用溫和的環(huán)軌搖晃式反應(yīng)器，減少剪切應(yīng)力和細(xì)胞損傷，延長有效細(xì)胞培養(yǎng)時間，提升蛋白產(chǎn)量；
? CBoost® 加強(qiáng)型工藝：在培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的篩選中采用漢騰生物的CBoost®加強(qiáng)工藝平臺，可將難表達(dá)蛋白的產(chǎn)量提升2倍。
通過對上游生產(chǎn)工藝的精細(xì)調(diào)控，DTEasy平臺能夠顯著提高難表達(dá)蛋白的產(chǎn)量，為客戶后續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步CMC開發(fā)提供了可靠的工藝基礎(chǔ)。
結(jié)論
漢騰DTEasy工具箱，釋放難表達(dá)蛋白潛力
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綜上，漢騰DTEasy平臺通過分子設(shè)計、優(yōu)選宿主、細(xì)胞系載體優(yōu)化以及定制工藝，多管齊下，全面解決了難表達(dá)蛋白的開發(fā)痛點(diǎn)。借助DTEasy平臺，可幫助客戶釋放高價值但傳統(tǒng)上難以表達(dá)的治療性蛋白藥物的生產(chǎn)潛力，加快了開發(fā)進(jìn)度，為患者獲得更加創(chuàng)新的生物治療藥物提供了更多機(jī)會。